Impairing methylations at ribosome RNA, a point mutation-dependent strategy for aminoglycoside resistance: The rsmG case / Mutaciones en genes modificadores de ARN ribosómico y la resistencia a aminoglucósidos: el caso del gen rsmG

Introduction: Aminoglycosides like streptomycin are well-known for binding at specific regions of ribosome RNA and then acting as translation inhibitors. Nowadays, several pathogens have been detected to acquire an undefined strategy involving mutation at non structural ribosome genes like those acting as RNA methylases. rsmG is one of those genes which encodes an AdoMet-dependent methyltransferase responsible for the synthesis of m 7 G527 in the 530 loop of bacterial 16S rRNA. This loop is universally conserved, plays a key role in ribosomal accuracy, and is a target for streptomycin binding. Loss of the m 7 G527 modification confers low-level streptomycin resistance and may affect ribosomal functioning. Objectives: After taking into account genetic information indicating that some clinical isolates of human pathogens show streptomycin resistance associated with mutations at rsmG , we decided to explore new hot spots for mutation capable of impairing the RsmG in vivo function and of promoting low-level streptomycin resistance. Materials and methods: To gain insights into the molecular and genetic mechanism of acquiring this aminoglycoside resistance phenotype and the emergence of high-level streptomycin resistance in rsmG mutants, we mutated Escherichia coli rsmG and also performed a genotyping study on rpsL from several isolates showing the ability to grow at higher streptomycin concentrations than parental strains. Results: We found that the mutations at rpsL were preferentially present in these mutants, and we observed a clear synergy between rsmG and rpsL genes to induce streptomycin resistance. Conclusion: We contribute to understand a common mechanism that is probably transferable to other ribosome RNA methylase genes responsible for modifications at central sites for ribosome function.

Introducción. Los aminoglucósidos son moléculas antibióticas capaces de inhibir la síntesis de proteínas bacterianas tras su unión al ribosoma procariota. La resistencia a aminoglucósidos está clásicamente asociada a mutaciones en genes estructurales del ribosoma bacteriano; sin embargo, varios estudios recientes han demostrado, de forma recurrente, la presencia de un nuevo mecanismo dependiente de mutación que no involucra genes estructurales. El gen rsmG es uno de ellos y se caracteriza por codificar una metiltransferasa que sintetiza el nucleósido m 7 G527 localizado en el loop 530 del ribosoma bacteriano, este último caracterizado como sitio preferencial al cual se une la estreptomicina. Objetivo. Partiendo de las recientes asociaciones clínicas entre las mutaciones en el gen rsmG y la resistencia a estreptomicina, este estudio se propuso la caracterización de nuevos puntos calientes de mutación en este gen que puedan causar resistencia a estreptomicina usando Escherichia coli como modelo de estudio. Materiales y métodos. Se indagó sobre el mecanismo genético y molecular por el cual se adquiere la resistencia a estreptomicina y su transición a la resistencia a altas dosis mediante mutagénesis dirigida del gen rsmG y genotipificación del gen rpsL . Resultados. Se encontró que la mutación N39A en rsmG inactiva la proteína y se reportó un nuevo conjunto de mutaciones en rpsL que confieren resistencia a altas dosis de estreptomicina. Conclusiones. Aunque los mecanismos genéticos subyacentes permanecen sin esclarecer, se concluyó que dichos patrones secuenciales de mutación podrían tener lugar en otros genes modificadores del ARN bacteriano debido a la conservación evolutiva y al papel crítico que juegan tales modificaciones en la síntesis de proteínas.

Efeito de diferentes antibióticos no processo de reparo em reimplante de dentes mantidos em leite: estudo em ratos / Effect of different antibiotics in the repair process reimplantation in teeth maintained in milk

A utilização do meio de conservação para manutenção da viabilidade celular do ligamento periodontal e polpa após a avulsão, caso o elemento dentário não seja reimplantado imediatamente, é necessário. Se os dentes forem mantidos em meio seco ou saliva, recomenda-se o tratamento tópico com a tetraciclina antes do reimplante para favorecer a revascularização pulpar e o reparo do ligamento periodontal. No entanto faltam estudos sobre esse tratamento quando o dente avulsionado é mantido em leite. O objetivo deste trabalho foi avaliar histomorfometricamente o efeito de diferentes antibióticos no processo de reparo do ligamento periodontal e do tecido pulpar de dentes avulsionados mantidos em leite. Os incisivos superiores direito de 40 ratos Wistar (machos) foram extraídos, mantidos em leite e/ou meio seco e reimplantados. Os animais foram divididos de acordo com o meio de tratamento prévio ao reimplante: Grupo IM reimplante imediato. No Grupo DOX, o incisivo foi imerso em leite (40C) por 60 minutos e após em 10 ml de solução de Doxiciclina (0,05mg/ml) por mais 5 minutos. No grupo PEN, o incisivo foi mantido em leite (40C) associado com 10000UI de penicilina e 100mg de estreptomicina por 65 minutos. No grupo MS, o incisivo foi mantido em meio seco por 65 minutos. Os animais foram eutanasiados aos 60 dias pós-operatório, as amostras foram processadas e analisadas histomorfométricamente. Foi avaliada área de reabsorção por substituição, reabsorção inflamatória, ligamento periodontal com e sem reinserção, revascularização e reparo pulpar. O teste não paramétrico Kruskall-Wallis (p> 0,05) foi utilizado para calcular as variáveis, e o reparo pulpar foi analisado por escores. As análises estatísticas demonstraram diferenças entre grupos apontando maior reabsorção no grupo MS, assim como foi observado uma menor reabsorção inflamatória no Grupo PEN, além disso uma maior extensão de ligamento periodontal e melhor inserção nos grupos IM e PEN...

A storage media use for maintanance of cell viability after pulp and periodontal ligament avulsion, if the tooth isn ́t reimplanted immediately is necessary. If the teeth are kept in a dry medium or saliva , it is recommended a topical treatment of the root with tetracycline before the reimplantation to promote pulp revascularization and periodontal ligament repair. However lack of studies on the treatment when the avulsed teeth is kept in milk . The aim of this research was to evaluate by histomorphological analysis the effect of different antibiotics in repair process of the ligament periodontal and pulp tissue of the avulsed tooth storage in milk. In forty rats Wistar (male) was carried out to upper right incisor extraction, were storage dry and/or salive and posterior reimplantation. The animals were divided according to the storage media before reimplantation: Group IM: immediate replantation. In the group DOX, the incisor was immerse in milk (4o) for 60 minutes, then it was immerse in 10 ml of solution of Doxycycline (0,05mg/ml) for 5 minutes. In the group PEN the incisor was storaged in milk (4o) associated with penicillin 10000UI plus 100mg of streptomycin for 65 minutes. In the group MS, the incisor was storaged in dry media for 65 minutes. The animals were euthanized after sixty days post-operation. The samples were processed and analyzed for histomorphometrically. It was evaluated reabsorption by substitution, inflammatory reabsorption, the periodontal ligament and their reinsertion, revascularization and pulp repair. The non-parametric Kruskall-Wallis (p> 0,05) test was used to evaluate the variables but pulp repair was analyzed by scores. Statistical analysis showed differences among groups pointed out major reabsorption on the Ms group, as well as was observed a minor inflammatory reabsorption in the Pen group, in addition to more periodontal ligament extension and better periodontal ligament insertion in IM and PEN groups...

Evaluation of screening tests for antimicrobial residues in milk from individual cows treated with a combination of penicillins G and streptomycin / Valoración de pruebas de campo para detección rápida de residuos antimicrobianos en leche individual de vacas tratadas con una combinación de penicilinas y estreptomicina / Valoração de testes de campo para detecção rápida de resíduos antimicrobianos em leite individual de vacas tratadas com uma mistura de penicilinas e estreptomicina

Abstract Background: in Colombia, the law (Resolution 1382, 2013) prohibits the sale of milk that contains any antimicrobial drug residues, although no specific official screening tests and detection limits have been specified. At present, milk with positive results to both the Delvotest® and Snap® assays is simply rejected. To avoid contaminating bulk tanks with milk from individually treated cows, producers would benefit from having on-farm screening tests to conduct their own quality controls. In addition, on-site testing would allow farmers to check if the withdrawal times of commercially-available generic products are in accordance with labeled recommendations. Material and Methods: In this study, two commonly used rapid detection tests (Delvotest® and SNAP® specific for beta-lactams) were used on milk from 39 subclinical mastitic Holstein cows that were prescribed with daily intramuscular injections of a commercial suspension containing 8.000.000 IU of penicilin G (75% procaine penicilin G, 25% potasium penicillin) and 8 g of streptomycin sulfate, for a total of 4 days. Cows were individually milked and samples collected every 12 hours the day before, and for 3 days after the recommended withdrawal time of three days post-treatment. To inactivate the potential action of natural inhibitors of microbial growth that may be present in milk (ie., lysozyme and lactoferrin), the results of the Delvotest® were compared before and after milk samples were subjected to heat treatment (82°C for 5 minutes). Results: When the Delvotest® was used as per manufacturer's instructions (i.e., without heating), 7 of 39 cows were positive for one more day past the recommended withdrawal period. However, the results of the Snap® specific for beta-lactams and Delvotest® post-heating showed that only 2 of those 7 cows were positive, suggesting that 5 animals gave false positive results. For the 312 milk samples analyzed, a high degree of concordance was observed (Kappa coefficient=0.74±0.1) between the Snap® and Delvotest® post-heating. Conclusions: Considering that the streptomycin in this product is known to be eliminated faster than penicillin-G, the results suggest that the efficacy of the Delvotest® (after heat treatment) is similar to that of the Snap® beta-lactams for the detection of penicillin residues. However, when the Delvotest® was not preceded by heat treatment to inactivate potential natural inhibitors, it yielded a high number of false-positive results. The results also showed that in 95% (37/39) of the cows treated with this commercial product, the labeled instructions of a 3 day withdrawal period were adequate for compliance within the law.

Resumen En Colombia, la ley (Resolución 1382, 2013) prohíbe la venta de leche que contenga residuos de cualquier medicamento antimicrobiano, aunque no se especifican pruebas oficiales ni límites de detección que deban cumplir. Actualmente, la leche que emite resultados positivos a los kits del Delvotest® y Snap® simplemente es rechazada. Para evitar contaminar tanques de acopio con leche de vacas tratadas, los productores se beneficiarían de tener pruebas in situ que les permitan hacer sus propios controles. Además, ello permitiría comprobar si los tiempos de descarte de productos comerciales cumplen con las recomendaciones de los insertos. En este estudio se evaluaron dos pruebas de detección rápida (Delvotest® y SNAP® específico parar beta-lactámicos) en leche de 39 vacas con mastitis subclínica que fueron tratadas con inyecciones diarias intramusculares de una suspensión comercial de 8.000.000 UI de penicilina G (75% penicilina procaínica G, 25% penicilina potásica) y 8 g de sulfato de estreptomicina, durante 4 días. Las vacas se ordeñaron manualmente y recolectaron muestras de leche, cada 12 horas, por 1 día antes y 3 después del tiempo de retiro recomendable de 3 días post-tratamiento. Para inactivar la acción de inhibidores naturales del crecimiento bacteriano que pueden estar presentes en leche (ej, lisozima y lactoferrina), los resultados del Delvotest® se compararon antes y después de que las muestras de leche fuesen sometidas a calentamiento (82°C por 5 minutos). Cuando el Delvotest® se usó de acuerdo a las instrucciones de la compañía, es decir, sin calentamiento, 7 de 39 vacas dieron positivas por ≥ 1 días pasado el tiempo de retiro recomendado. Sin embargo, los resultados del Snap® y Delvotest® post-calentamiento mostraron que sólo 2 de las 7 vacas eran positivas, sugiriendo que 5 animales estaban dando falsos positivos. En las 312 muestras de leche analizadas se obtuvo un alto grado de concordancia (coeficiente Kappa = 0.74±0.1) entre el Snap® y el Delvotest® post-calentamiento. En conclusión, los resultados sugieren que la eficacia del Delvotest® (post-calentamiento) es similar a la del Snap® específico para beta-lactámicos en lo que respecta a detección de residuos de penicilina. Sin embargo, cuando el Delvotest® no iba precedido de calentamiento para inactivar inhibidores naturales, se produjeron demasiados falsos positivos. Los resultados también mostraron que en el 95% (37/39) de las vacas tratadas con este producto, la recomendación de descarte por 3 días cumplía con la legislación vigente de no contener residuos.

Resumo Na Colômbia, a lei (Resolução 1382 de 2013) proíbe a venda do leite que tenha resíduos de qualquer medicamento antimicrobiano, embora não se especifiquem testes oficiais nem limites de detecção que devam se cumprir. Atualmente, o leite que emite resultados positivos aos Kits de Delvotest® e Snap® simplesmente é rejeitado. Para evitar contaminar os tanques de armazenamento com leite de vacas tratadas, os produtores beneficiar-se-iam de ter os testes in situ que lhes permita fazer seus próprios controles. Além, isto permitiria comprovar se os tempos de retiro do leite ao utilizar produtos comerciais cumprem com as recomendações da vide bula. Neste estudo avaliaram-se dois testes de detecção rápida (Delvotest® e SNAP® especifico parar beta-lactâmicos) no leite de 39 vacas com mastite subclínica que foram tratadas com injeções diárias intramusculares de uma suspensão comercial de 8.000.000 UI de penicilina G (75% penicilina procaína G, 25% penicilina potássica) e 8g de sulfato de estreptomicina durante quatro dias. Extraiu-se o leite das vacas com ordenha manual e se fez uma amostragem de leite (cada 12 horas) um dia antes e três dias depois do tempo de retiro do leite, que tinha como recomendável, na vide bula, três dias após final do tratamento. Para inativar a ação de inibidores naturais do crescimento bacteriano, que possam estar presentes no leite (ex. lisozima e lactoferrina), os resultados do Delvotest® compararam-se antes e depois de que as amostras de leite fossem sometidas a aquecimento (82°C durante 5 minutos). Quando o Delvotest® usou-se de acordo com as instruções da companhia, quer dizer, sem aquecimento, sete das 39 vacas deram positivas por ≥ 1 dia passado o tempo de retiro recomendado. Embora, os resultados do Snap® e Delvotest® após aquecimento do leite mostraram que só dois das sete vacas eram positivas, sugerindo que cinco animais estavam apresentando falsos positivos. Nas 312 amostras de leite analisadas obteve-se um alto grau de concordância (coeficiente Kappa = 0.74±0.1) entre o Snap® e o Delvotest® após aquecer o leite. Em conclusão, os resultados sugerem que a eficácia do Delvotest® (após o aquecimento do leite) é similar á do Snap ou especifico para beta-lactâmicos no que respeita a detecção de resíduos de penicilina. Embora, quando o Delvotest® não ia precedido do aquecimento do leite para inativar inibidores naturais, produziram-se muitos falsos positivos. Os resultados também demonstraram que o 95% (37/39) das vacas tratadas com este produto, estavam de acordo com a recomendação de descarte por três dias e cumpria com a legislação vigente de não conter resíduos.

Identificação de genes com expressão modulada por estreptomicina e de genes associados à virulência e patogenicidade em Xylella fastidiosa / Identification of genes modulated by streptomycin and of genes related to virulence and pathogenicity in Xylella fastidiosa

Em concentrações subletais, agentes antimicrobianos modulam a expressão gênica bacteriana, sendo que o conjunto de genes que é modulado depende tanto da cepa bacteriana, como da natureza do agente antimicrobiano. Neste trabalho, avaliamos o perfil de expressão gênica de Xylella fastidiosa cepa 9a5c em resposta ao tratamento por até 60 minutos com dose subletal do antibiótico estreptomicina. Esta é uma cepa virulenta, originalmente isolada de laranjeiras com sintomas de clorose variegada dos citros. A hibridização de microarranjos de DNA representando 2608 das 2848 sequências codificadoras (CDS) previamente anotadas no genoma desta cepa, revelou que 136 CDS apresentaram expressão gênica diferencial em resposta à exposição à estreptomicina, sendo que destas 109 foram negativamente moduladas e 27 positivamente moduladas. Realizamos, também, ensaios de PCR quantitativo precedido de transcrição reversa (RTqPCR) de 21 CDS para confirmar a modulação observada na análise global da expressão gênica. O perfil de expressão gênica de X. fastidiosa em resposta à estreptomicina foi analisado de forma integrada com outros perfis de expressão gênica desta bactéria. Entre as CDS positivamente moduladas, destacamos aquelas codificadoras das chaperoninas GroEL e GroES, que estão associadas a resposta de choque térmico, e CDS associadas à tradução, tais como proteínas ribossomais e fatores de tradução. Interessantemente, a exposição à estreptomicina induz a expressão da CDS que codifica poligalacturonase, que é um fator de virulência em algumas cepas de X. fastidiosa. Por outro lado, o tratamento com estreptomicina promoveu a modulação negativa de CDS relacionadas à formação e manutenção de biofilme ao contrário do observado quando estas bactérias foram submetidas ao tratamento com gomesina, um peptídeo antimicrobiano. O conjunto destas observações sugere que a exposição à dose subletal de estreptomicina possa promover um fenótipo de maior virulência, contrariamente ao efeito...

At sublethal concentrations, antimicrobials compounds modulate bacterial gene expression and the gene set that is modulated depends not only on the bacterial strain but also on the nature of antimicrobial agent. In this study, we evaluated changes in gene expression profile of Xylella fastidiosa strain 9a5c exposed up to 60 min to sublethal concentration of streptomycin. This a virulent strain originally isolated from orange trees with symptoms of citrus variegated chlorosis. Hybridization of DNA microarrays representing 2,608 out of 2848 coding sequences (CDS) previously annotated in strain 9a5c genome revealed 136 CDS differentially expressed upon streptomycin treatment. Of which 109 were down-regulated and 27 up-regulated. Differential expression for a subset of 21 CDS was further evaluated by reverse transcriptionquantitative PCR (RT-qPCR). In addition, we performed an integrated analysis of the gene expression profile of X. fastidiosa in response to streptomycin along with other gene expression profiles available for this bacterium. Among the up-regulated CDS, we highlight those encoding chaperonins GroEL and GroES, which are associated with heat shock response, and those CDS related to translation, such as ribosomal proteins and translation factors. Interestingly, exposure to streptomycin induces the expression of a CDS encoding polygalacturonase, which is a virulence factor for some X. fastidiosa strains. Furthermore, treatment with streptomycin down-regulates some CDS related to biofilm formation oppositely to treatment with gomesin, an antimicrobial peptide. Together, these observations suggest that exposure to sublethal dose of streptomycin might promote a higher virulent phenotype, in contrast to the effect previously observed with gomesin. In the present work, we also describe the pyrosequencing of J1a12 genome, a X. fastidiosa strain that exhibits a less virulent phenotype in citrus and tobacco if compared to strain 9a5c. A comparison of genome...

Concordancia de métodos para susceptibilidad antimicrobiana en cepas de Mycobacterium tuberculosis aisladas en Montería, Córdoba: tubo indicador de crecimiento micobacteriano vs. método de las proporciones múltiples / Agreement between methods for antimicrobial susceptibility to Mycobacterium tuberculosis strains isolated in Montería, Córdoba: mycobacteria growth indicator tube vs. proportion method

Objetivo: Evaluar la concordancia del método manual MGIT AST SIRE (mycobacteria growth indicator tube for antimicrobial susceptibility testing to isoniazid, rifampin, ethambutol and streptomycin) frente al método de proporciones múltiples (PM) para determinar susceptibilidad antimicrobiana en cepas de Mycobacterium tuberculosis. Métodos: Se analizaron 45 cepas de M. tuberculosis aisladas en la ciudad de Montería, entre 2003 y 2005, para susceptibilidad a (INH), rifampicina (RMP), etambutol (EMB) y estreptomicina (SM). El anßlisis de concordancia del método MGIT manual vs PM, se realizó con la prueba Kappa. Resultados: De las 45 cepas analizadas, 38 tuvieron idéntico resultado con ambos métodos y 7 tuvieron resultados discordantes. Los porcentajes globales de resistencia a drogas antituberculosas de las cepas analizadas por el MGIT manual y las PM fueron de 33.3% y 31.1%, respectivamente, la MDR fue 5 (11.1%) por PM y de 4 (8.8%) por MGIT manual. La concordancia del MGIT AST SIRE con el PM fue 95.5% para cada una de las drogas analizadas y kappa global de 0.8374. En cada antibiótico se encontraron dos cepas discordantes para INH, RIF (un falso resistente y un falso susceptible). En STR y EMB (dos falsos sensibles). El tiempo promedio de resultado para cualquiera de los antimicrobianos fue 6.5 días (rango 5-8 días) por MGIT, mientras que para PM fue 20 a 25 días. Conclusión: El presente estudio mostró que MGIT manual es concordante con PM, es rßpido, sencillo y eficaz, para determinar la susceptibilidad de cepas de M. tuberculosis.

Objective: To evaluate the agreement of manual MGIT (mycobacteria growth indicator tube for antimicrobial susceptibility testing to isoniazid, rifampin, ethambutol and streptomycin) for susceptibility testing vs proportion method on Lowenstein-Jensen (PM) in Mycobacterium tuberculosis strains. Methods: A total of forty-five isolates of M. tuberculosis were tested for susceptibility to isoniazid (INH), rifampin (RMP), ethambutol (EMB), and streptomycin (SM). The strains were isolated in Montería, during 2003 and 2005. The agreement between the two assays mentioned was estimated by the Kappa test. Results: There were thirty-eight strains with identical results while 7 had discrepant results with both methods. The overall resistance to antituberculosis drugs were 33.3% y 31.1% for manual MGIT and PM, respectively. MDR was 5 (11.1%) by PM and 4 (8.8%) by manual MGIT. The agreement between MGIT AST and PM was 95.5% for all drug tested and overall kappa value 0.8374. Two discrepancies were found in each drug; with INH and RIF (one false resistant and one false susceptible). STR and EMB (two false susceptibles). Turnaround times were 5 to 8 days (median, 6.5 days) for MGIT and 20 to 25 days for MP. Conclusions: These preliminary data show a good level of agreement between manual MGIT AST SIRE and MP. Also MGIT is a rapid, easy and efficient method for the drug susceptibility testing of M. tuberculosis.

Adherence and experimental infection of bacteria associated with periodontal infections of young cattle in Brazil ("Cara inchada")

In vitro- and in vivo-assays were conducted, to study the possible role of streptomycin- and actinomycin-producing soil actinomycetes for the pathogenesis of "Cara inchada" in cattle (CI). Adherence of Bacteroides spp. to epithelial cells of the bovine gingiva, known to be associated with the progressive lesions of CI, was significantly increased by the addition of streptomycin, actinomycin or antibiotic culture supernatants of the soil actinomycetes. Applications of these mixtures together with Actinomyces pyogenes to the marginal gingiva of the upper premolar teeth of about 1 month old Holstein Friesian calves did not lead to progressive lesions of CI. Only one calf exhibited a slight diarrhea and a temporary retraction of the gingiva at the site of application.

Foram realizados ensaios in vitro e in vivo para estudar o possível envolvimento de actinomicetos do solo como produtores de estreptomicina e actinomicina na pathogênese da periodontite da ,,cara inchada" dos bovinos (CI). A aderência de Bacteroides spp. às células epitheliais da gengiva marginal de bezerros, dos quais se sabe estarem associados às lesões progressivas da CI, aumentou significantivamente através a adição de estreptomicina, actinomicina ou de antibióticos produzidos pelo cultivo de actinomicetos do solo. Aplicações de Bacteroides spp. e Actinomyces pyogenes, junto com os antibióticos, na gengiva dos dentes premolares maxilares de bezerros da raça holandês preto-branco, de cerca de 1 mês de idade, não provocaram lesões progressivas da CI. Somente um bezerro mostrou leve diarréia e retração temporária da gengiva no local da aplicação.